TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR

Una suspensión celular se caracteriza por
presentar un número de partículas microscópicas
dispersas en un fluido. Habitualmente será
necesario determinar tanto la densidad de
las células en la suspensión como el porcentaje
de éstas que son viables.Para determinar la
densidad de las células se emplean diferentes
técnicas, desde la relativamente simple cámara
de contaje celular de la que existen numerosas
variantes, entre ellas la que empleamos (cámara
de Neubauer), hasta equipos automáticos de
contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa.
El principio del contador celular se basa en la medida
de los cambios en la resistencia eléctrica que se
producen cuando una partícula no conductora en
suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño
orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequeña
abertura entre los electrodos es la zona sensible a
través de la que pasan las partículas que se encuentran
en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio
desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen
desplazado es medido como un pulso de voltaje. La
altura de cada pulso es proporcional al volumen de la
partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que
circula a través del orificio es posible contar y medir el
tamaño de las partículas. Es posible contar y medir
varios miles de partículas por segundo, independientemente
de su forma, color y densidad.En la unidad de Citometría de
flujo y Microscopia Confocal de los Servicios Científico-
Técnicos de la Universidad de Barcelona se dispone de
contadores celulares.Sin embargo, es posible determinar
la densidad celular empleando métodos más sencillos.
Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej.
La cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara
de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca
una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo
presenta unas señales que determinan un volumen conocido
(x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número
de partículas presentes en ese volumen se puede
determinar la densidad de partículas en la suspensión
de origen.La cámara de Neubauer es una cámara de
contaje adaptada al microscopio de campo claro o al
de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con
una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula
como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3
mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de
0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión
central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto
a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie
L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es
decir 0.1 microlitro.En la imagen puedes observar el
aspecto de una de las regiones marcadas como L y que
en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16
pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta
imagen ha sido tomada empleando un microscopio
invertido de contraste de fases.Existen numerosos
modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a
su uso en microscopía. En la imagen puedes observar
una cámara de Neubauer doble, como las que usas en
el laboratorio de prácticas.Para determinar la viabilidad
celular se emplean diferentes métodos. El más común es
el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide
que se introduce en el interior de las células que presentan
roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen
en la imagen, claramente de color azul, son consideradas
no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a células
viables es un error pues por este método se sobrevalora la
viabilidad de las células en la suspensión, determinando
como inviables sólo aquellas con la membrana rota.